分子クローニングと発現ククミシン (Cuc m 1)、サブチリシン様物質ククミスメロのプロテアーゼ大腸菌

モジタバ・サンキアン1、ファリデ・タレビ1、マリヘ・モガダム1、ファテメ・ヴァヘディ2、
ファラザド・ジャバリ・アザド3、アボルレザー・ヴァラステ1、4
抽象的な
背景: 植物由来の食品に起因する口腔アレルギー症候群は成人に多く見られます。 アレルギー
メロン (cucumis melo) は、イランで最も頻繁に起こる果物アレルギーの 1 つです。 3つの異なる主要アレルゲンには、
ククミスメロでは、Cuc m 1 (ククミシン) がメロンの主要アレルゲンであることが判明しました。 ククミシンはアルカリセリンプロテアーゼであり、前駆体形態の 78 kDa タンパク質として見られます。 この目的
研究は、大腸菌（E. coli）細胞における組換えCuc m 1の産生とそのアレルギー誘発性特性の特性評価でした。
方法: 組換えCuc m 1の生産は、pET32b(+)へのcDNAクローニング技術によって実行されました。
Genebankデータベースで入手可能なククミシンヌクレオチド配列、ククミシンをコードする遺伝子、および方向性クローニング法に基づいて設計された特異的プライマーを使用したベクター。 大腸菌TOP10にクローン化したプラスミドを大腸菌BL21に形質転換し、IPTGによりタンパク質の発現を誘導した。 組換えタンパク質は、組換えタンパク質のヒスチジンタグを使用する Ni-NTA アフィニティークロマトグラフィーによって精製されました。 このタンパク質の IgE 結合
IgE免疫ブロット法、ELISAおよび阻害ELISAによって評価した。
結果: 方向性クローニングにより、融合 Cuc m 1 が発現しました。
メロンにアレルギーのある患者は、精製タンパク質バンドに対して強い反応性を示しました。 実証された阻害アッセイ
精製されたrCuc m 1 は、全抽出物中の天然型のCuc m 1 と同じである可能性があります。
結論: 本研究では、機能的組換えククミシン アレルゲン rCuc m 1 を提供しました。
86 kDa で、メロンに対するアレルギーの臨床診断および研究のための標準アレルゲンとして使用される可能性があります。
キーワード
アレルギー、クローニング、ククミシン、ククミメロ、ズブチリシン様プロテア

問題.10
最も一般的な食物アレルゲンには牛が含まれます
牛乳、卵、ピーナッツ、木の実、大豆、小児用
人口。 成人が報告する最も一般的な食物アレルギーは果物と野菜に対するアレルギーです
小麦など。 ピーナッツ、木の実、魚、貝類。2,11
メロンまたは一般的なメロン (Cucumis melo spp.) はウリ科に属しており、感作された人にアレルギー症状を引き起こす可能性があります。12
メロン (ペルシア語でハルボゼ) はイランのどこでも栽培されており、その品種は数多くあります。13
メロンはイランで人気の果物であり、
メロンに対する食物アレルギーの割合が高いため（未発表データ）、さらなる研究を支援するためにメロンの組換えアレルゲンの生産に研究が焦点を当てています。
13 ～ 60 の間のいくつかの IgE 結合タンパク質
プールされたメロン抽出物から kDa が検出されました
メロンアレルギー患者の血清。14 A 13 kDa
主要な反応性タンパク質バンドが検出され、
脂質輸送タンパク質はプロフィリンとして同定されています15。
ククミシンとしても知られる Cuc m 1 は、カゼイン分解活性を持つ植物性アルカリセリンプロテアーゼで、牛乳のカゼインを変性する可能性があります。17
タンパク質はアルカリ性 pH と熱に耐性があり、最適 pH は約 10、最適温度は約 10 です。
70℃。 ククミシンの反応性セリン残基周囲のテトラアミノ酸配列は、
ズブチリシン、Bacillus subtilis セリンプロテアーゼ。18,19
これら最後の 2 つのタンパク質はペプシンに対して非常に耐性があります。
消化しやすく、熱にも安定しているため、強力なアレルゲンとなる可能性があります。15,16
天然型ククミシンの分子量
メロンの果汁からの感染が報告されている 67
kDa.18-20 この 67 kDa 酵素は自己消化により 14 kDa ポリペプチドと 54 kDa プロテアーゼを生成します
さらなる加工に耐性があるため、
54 kDa ククミシンと同一であると考えられています。
は以前に報告されています。 プロテアーゼ (カゼイン分解) 活性は自己分解後も残ります。21、22
ククミシンの配列は推定されており、
をコードする 2552 bp のヌクレオチド配列として定義されます。
4 つの機能ドメインからなる 78 kD 前駆体タンパク質の場合: 22 アミノ酸のシグナルペプチド、88 アミノ酸のシグナルペプチド
アミノ酸 NH 末端プロ配列、505 残基を持つ 54 kDa プロテアーゼ ドメイン。
67 kDa 天然ククミシンの酵素ドメイン、および
116 残基の 14 kDa COOH 末端ポリペプチド。67 kDa 天然ククミシンの自己分解生成物です。19、20、22-24 67 kDa 天然ククミシン
当然、メロンの果汁に含まれています。18,25
この研究の目的は、cDNA 配列のクローニングとククミシン、Cuc m 1 の発現でした。さらに、大腸菌における Cuc m 1 の発現、その精製、およびそのアレルゲン性の評価も目的でした。

方法
被験者とセラ
～に感作された8人のグループからの血清
アレルギー専門医が厳選したメロン
採用された患者の病歴と皮膚プリックテスト
免疫アレルギー科への人々、
イラン、マシュハドのガーム病院（表 1）。
個々の等量のアリコートを混合することにより、
血清、血清プールを調製し、-80℃に保存した。
総メロン抽出物を用いて皮膚プリックテストを分科会のガイドラインに基づいて実施しました。
欧州アレルギー学会の皮膚テストと
臨床免疫学許可取得後
各患者からの書面による同意を得た。26
この研究は地元の倫理委員会によって承認されました。 の
アレルギーの兆候がなく、皮膚プリックテストが陰性だった 8 人の健康な被験者からの血清が収集されました。
アッセイにおけるネガティブコントロールとして使用します。
総 IgE レベルは市販の測定器で評価されました。
メーカーの仕様に従って利用可能なELISAキット
説明書 (Total IgE IRMA キット、Radim、イタリア)。
トータルエキス
全抽出物は、前述したように若干の変更を加えて調製されました。27 簡単に説明すると、熟したメロンの果実を洗浄した後、果肉の内部が
分離し、ホモジナイザーを使用して均質化しました。
抽出緩衝液、リン酸緩衝液 100 mM、pH
2% (wv) ポリビニルピロリドンを含む 8 と 10
mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)
１：１０ｗｖ比で均質化混合物に添加した。 の
スラリーをマグネティックスターラーで2時間混合し、その後
4℃で遠心分離（15000g、30分間）します。
上清を分離し、透析した。
リン酸緩衝液（100 mM、pH 7.4）、4℃で24時間。
抽出物を凍結乾燥し、-80℃で保存しました。
使用。
メロン果実からのRNA抽出
メロンの上層1グラムを1リットルで冷凍した

図 1 ゲルアガロース電気泳動、M: PCR マーカー (1 kb
DNA ラダー、フェルメンタス: 断片サイズを上から下まで、
10000、8000、6000、5000、4000、3500、3000、2000、1500、
1000、750、500、250 bp)。 a: cDNAのPCR増幅
Cuc m 1 をコード化しています。2193 bp Cuc m 1 の PCR 産物が見られます。
b: レーン 1、2193 bp Cuc m 1 PCR 産物
Xho IおよびNot I制限酵素で処理し、精製したものです。
レーン 2、Xho I および Not I で処理したプラスミドを精製しました。

窒素を加えて細かく粉砕します。 総RNA
チオシアン酸グアニジンを使用して抽出されました。
チョムチンスキー法.28
cDNAエンコーディングのPCR増幅
立方メートル1
RNA から cDNA を合成した後、
ファーストストランド cDNA 合成キット Fermentas
製造業者の指示に従い、プライマーとしてオリゴ (dT) 18 を使用し、Cuc m 1 特異的な増幅を行います。
cDNA フラグメントは、特定の方法を使用して実行されました。
Gene Runner ソフトウェア (http:
www.generunner.com)。
(センスプライマー: 5’- ATTAGCGGCCGCAATGTCTTC
Not I サイトが組み込まれた TTCTCTAATCTTCAA-3'、
アンチセンスプライマー: 5’- ATACTCGAGAACTAGACTTG
TGATGTTATAGG -3' (Xho I サイトが組み込まれている)。
クローン作成
予測された 2193 bp の PCR 産物が精製されました
DNA抽出を使用した低融点アガロースゲルからの抽出
キット (QIA クイックゲル抽出キット、QIAGEN、Hilden、
ドイツ)、pET32b(+) ベクターにクローン化されました。
大腸菌チオレドキシンとの融合発現系
(Novagen、マディソン、ウィスコンシン州、米国)。これは、His タグを含む組換え融合タンパク質を発現します。

図 2 SDS-PAGE (10%) ゲルのクマシーブルー染色
細菌溶解物中のCuc m 1発現の分析用。 レーン
MW: 分子量マーカー、kDa 単位のサイズ、レーン 1 および 2: IPTG 誘導後に構築されたプラスミドを含む細菌溶解物の不溶性相。 矢印は 86-kDa rCuc m 1 を示します。 レーン
3: 構築されたプラスミドを含む細菌溶解物の可溶相
IPTG誘導後。 発現したタンパク質は見られなかった
可溶相。

C末端。 コンストラクトは変換に使用されました
TOP10 大腸菌細胞。 適切なコロニーを選択し、アンピシリン寒天上で分析しました。 の忠実度
クローン化産物は、Cuc m 1 の特異的プライマーを使用した PCR 反応と、Xho I および Not I による制限酵素消化によって検証されました。
プラスミドの配列決定を行った（SeqLab、
ゲッティンゲン、ドイツ）。
大腸菌におけるCuc m 1の発現と精製
構築したプラスミドをコンピテント大腸菌 BL21 細胞 (Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド、
アメリカ合衆国）。 次に、形質転換細胞をLB上でインキュベートしました。
アンピシリンを含む寒天を一晩放置します。 タンパク質合成を、1 mM IPTG (イソプロピル β-Dチオガラクトシド) を用いて 5 ml 培養物中で 37℃ で 8 時間誘導し、その後遠心分離 (3000 g、
20分、4℃）。 細菌培養物のペレット
誘導の前後で溶解液に再懸濁した
緩衝液 (50 mM NaH2PO4、500 mM NaCl、および 2 mM
イミダゾール、pH 8) を使用し、3 回の凍結融解を行った
液体窒素を使ったサイクル。 rCucの生成
細胞溶解物の上清およびペレット画分の m 1
SDSPAGEで解析しました。
Ni-NTA アガロース (Invitrogen) を使用した金属アフィニティー クロマトグラフィーを実行して、組換え体を精製しました。